Медіатори утворюються в сомі нейрона і потім аксоном транспортуються в синаптичне закінчення. Відповідно до сформульованого в 1930-х роках закону Дейла, медіатор, виявлений в одному синапсі, повинен бути також медіатором у всіх інших синаптичних закінченнях того ж нейрона.
У вегетативної нервової системи ацетилхолін як медіатора виробляється нейронами, що знаходяться в ЦНС, а також у гангліонарних клітинах парасимпатичної частини.
Маленькі та просто влаштовані нейромедіатори – Наприклад, ацетилхолін [4] – утворюються з молекул-попередників прямо в цитоплазмі аксонної терміналі.
Медіатор утворюється або в тілі нейрона (і потрапляє в синаптичну бляшку, пройшовши через весь аксон), або безпосередньо в синаптичній бляшці. У синаптичній бляшці молекули медіатора упаковуються в синаптичні бульбашки, у яких зберігаються досі вивільнення.